首先說凍存液配方，常用的配方一般是兩種—— 90% FCS+10% DMSO 或 70% 培養(yǎng)基 + 20% FCS+10% DMSO,。前一種較貴，而且后一種凍存效果也不錯,，因此本人一般選用第二種配方。對于比較脆弱的細胞則選用前一種凍存液,。氣相液氮罐

凍存步驟比較簡單,，前期處理同細胞傳代，只是在離心后是直接吸取上清,，用手拍打離心管底部，加入適量凍存液使細胞完全懸浮后分裝于凍存管,。制后先將凍存管放入4℃ 冰箱,，約 40 min。 接著置于-20℃ 冰箱,，約60 min,。置于 -80℃ 超低溫冰箱中放置過夜。 最后置于液氮罐中長期保存,。 同時做好凍存記錄,，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項

1. 使用 DMSO 前,，不需要進行高壓滅菌,，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構,，以至于降低冷凍保護效果,。

2. 凍存時要選處于對數(shù)生長期的細胞,，這樣效果要好很多。

3. 不宜將凍存細胞放置在 0℃～-60℃ 這一溫度范圍內(nèi)過久,，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi),，是「危險溫區(qū)」。

4. 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量,，及時添加,。

5. 凍存液中的培養(yǎng)基要與培養(yǎng)時相同，避免細胞由于環(huán)境突然改變而死亡,，在凍存管上也要標明培養(yǎng)基種類,。

6. 凍存液不要預熱。

7. 程序凍存盒非常好用,，省事省時效果還好,，強烈推薦凍存使用凍存盒。氣相液氮罐

細胞復蘇的原則是快速融化：必須將凍存在 -196℃ 液氮中的細胞快速融化至 37℃,，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害,。

具體步驟

1. 將水浴鍋預熱至 40℃,。

2. 用 75% 酒精擦拭紫外線照射 30 min 的超凈工作臺臺面。

3. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管,、吸管,、培養(yǎng)瓶等等。

4. 根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號,。

5. 從液氮罐中取出細胞盒,，取出所需的細胞，同時核對管外的編號,。

6. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍,，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化,。

7. 約 1-2 min 后凍存管內(nèi)液體完全溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁。

8. 平衡后,，放入離心機中 3000 r/min 離心 3 min,。

9. 吸棄上清液。

10. 向凍存管內(nèi)加入1 ml培養(yǎng)液,，吹打制成細胞懸液,。

11. 最后將細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃ 和 5% CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi) 12-24 小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),，換液的時間由細胞情況而定,。

注意事項

復蘇時選用的培養(yǎng)基要符合凍存管上標明的培養(yǎng)基,。操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。自液氮或干冰容器中取出冷凍管,，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程,，此時蓋子易松掉,。