實驗原理 液氮罐

　　細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196~C液氮中低溫保存,，可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來,，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實驗,。而且適度地保存一定量的細(xì)胞,，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,，起到了細(xì)胞保種的作用,。除此之外,，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買,、寄贈、交換和運送某些細(xì)胞,。 細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下,，細(xì)胞內(nèi)水分透出,，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷,。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,，當(dāng)溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃),。

　　目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小,，溶解度大,，易穿透細(xì)胞。

　　實驗材料

　　儀器：液氮罐,、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶),、離心管、吸管,、離心機(jī)等

　　試劑：0.25%胰酶,、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基(即凍存液)

　　附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,，使其終濃度達(dá)5-20%,。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存,。

　　實驗步驟

　　1.消化細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

　　2.1000rpm離心10分鐘,，棄上清液,。

　　3.沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右,。

　　4.將懸液分至凍存管中,，每管1ml。液氮罐

　　5.將凍存管口封嚴(yán),。如用安瓿瓶則火焰封口,，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂,。

　　6.貼上標(biāo)簽,，寫明細(xì)胞種類，凍存日期,。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩,。

　　7.按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

　　注意：操作時應(yīng)小心,，以免液氮凍傷,。液氮定期檢查，隨時補(bǔ)充,，絕對不能揮發(fā)干凈,，一般30立升的液氮能用1～1.5月。液氮罐